生体関連 アンプリコンシーケンス解析

特 長

  • 様々な動物種の糞便、ヒト口腔内や皮膚検体といった幅広い検体に対応
  • DNA抽出からデータ解析までを一式としたセット価格でご提供(1検体から申し込み可能)
  • 細菌・アーキア16S rDNAは、当社微生物同定用データベースとRDP(Ribosomal database project)の2種類で解析
  • RNA解析も可能
  • すべて当社内で作業、解析

概 要

糞便、唾液、皮膚表面などの多様な生物種が混在する検体中の生物群集を解析する優れた方法のひとつです。生物種が混在する検体から直接抽出した混合DNAについて、検体を識別するためのバーコード配列を付加したプライマーによりPCR増幅~シーケンス解析を行い、一度に数万~数十万の配列を得る手法です。

検体ごとに異なるバーコード配列が付加されているため、数十種類の異なる検体由来の混合DNAを一度に解析しても、バーコード配列をもとに得られた塩基配列がどの検体に由来するかを判別することができます。

一度の解析で大量の塩基配列を得ることができることから、短時間でマイナーな細菌の検出も可能であり、T-RFLP、クローンライブラリー、DGGEなどの従来法よりも検出感度が高いと考えられます。さらに、従来法よりも多検体、多数の塩基配列解析を行う場合のコストパフォーマンスに優れています。

受入可能な検体

  • 生体検体A区分:糞便検体
  • 生体検体B区分:だ液などA区分以外
  • その他

由来検体の種類対象
ヒトヒト糞便DNA対象:細菌・アーキア・菌類
RNA対象:細菌・アーキア
実験動物類マウス、ラット等の動物糞便、腸管内容物
家畜類ブタ、ウシ、ウマ等の動物糞便
家禽類ニワトリ等の家禽糞便、腸管内容物
ペット類イヌ、ネコ等のペット糞便
その他魚類、昆虫等の糞便、腸管内容物

由来検体の種類対象
ヒト
(その他動物種はご相談ください)
唾液、プラークDNA対象:細菌・アーキア・菌類
RNA対象:細菌・アーキア
皮膚拭取物
膣内拭取物

由来検体の種類対象
DNA抽出物PCR増幅が確認されたDNA抽出物DNA対象:細菌・アーキア・菌類
RNA対象:細菌・アーキア
PCR 増幅が確認できたことを示す電気泳動像を必ずご提供下さい。

必要検体量・送付方法

検体の種類必要量留意点および送付方法
A

糞便、腸管内容物、 ルーメン液 採便容器(保存液なし) もしくは気密性の高い容器 0.2~0.5g採取後速やかに冷凍保存、冷凍輸送
採便容器(保存液あり)採取後速やかに冷蔵保存 冷蔵輸送推奨、常温輸送可
B

A区分以外
(口腔内容物(唾液、プラーク)、
皮膚拭取物など)
スワブ
メタフロキーパー(皮膚)
1.5mLチューブなど
0.2~1mL
(唾液)
唾液、舌苔、口腔粘膜、プラークを採取し、 速やかに冷凍保存、冷凍輸送
綿棒やコットンなどで広範囲を拭き取った検体は、極少量の適切な溶液(PBS、生理食塩水、滅菌水など)に移し、速やかに冷蔵保存、冷蔵輸送
血液、臓器、細胞組織の受け入れはお断りいたします。
DNA抽出物濃度:5ng/µL
総量:30µL以上
抽出後速やかに冷蔵保存、冷蔵輸送

作業の流れ

  • DNA抽出/精製
  • PCR増幅
  • PCR産物の定量
  • シーケンス配列決定
  • ペアエンド配列・アッセンブル
  • フィルタリング・キメラチェック
  • データ解析

※RNA抽出では核酸抽出、RNA精製、RT-PCRを行います。

RNAに関する補足

DNAを解析対象とするアンプリコン解析では全菌(生菌・死菌を問わず)を対象とします。
一方、RNAは微生物の活性を反映し、代謝活性の高い状態においてRNA量が多いため、RNAを解析対象とする場合、活性のある微生物の動的な群集構造を解析することが可能です。RNAを解析対象とする場合には、検体から抽出した核酸中に含まれる混合RNAを逆転写PCR反応(RT‐PCR)し、得られたcDNAを鋳型にPCR増幅を行います。RNAは、非常に不安定で分解し易いため、サンプリング前に当社までお問い合わせ下さい。

仕 様

対象微生物細菌・アーキア※1菌類
解析領域16S rDNA V3 ~ V4領域ITS2
リード長※2細菌 約430 bp / アーキア 約380 bp270~340bp
データベース※3RDP、および当社「微生物同定データベース」RDP
解析対象DNA/RNADNA
リード数※41万リード以上/検体
解析機種MiSeq (Illumina)

※1 糞便、腸管内容物は細菌・アーキア一括プライマーを推奨します。(技術情報 『糞便検体のプライマーについて』をご参照下さい)
※2 プライマー配列を除いた配列を取得します。
※3 RDP(Ribosomal database project)は公共の解析データベースです。
※4 クオリティフィルタリング、キメラフィルタリング後のリード数です。

納品内容・報告書サンプル

報告内容形式
シーケンスデータfastaファイル、fastqファイル
菌叢解析データcsvファイル
各種グラフファイルhtmlファイル
  • ドーナツグラフ
  • 解析例
  • 検体間比較グラフ
  • クラスター解析
  • 主成分分析

各検体で得られたDNA 塩基配列の帰属分類群を界、門、網、目、科、属、種の各階層で、ドーナツグラフの中心から外側へ順に示します。

異なる分類階層(門~属または種レベル)の帰属分類群とその割合を一つのグラフで同時に示すことで、群集構造の理解を視覚的にサポートします。
html ファイルで納品します。グラフ上でカーソルを移動することにより、各階層の各分類群の名前が表示されます。

・ 当社「微⽣物同定データベース」による界〜種レベルの解析例です。RDP では、界〜属レベルの解析結果をご報告いたします。
・ ⼀覧をエクセルファイルで納品いたします。

RDP では界~属レベルまで、テクノスルガ・ラボ微生物同定データベースでは種~門レベルの各分類階層で、帰属分類群の内訳を示します。図は、糞便、唾液、皮、土壌、汚泥、河川水の計6 検体を種レベルで比較した結果を示します。
デンドログラムおよび、ヒートマップ画像が階層(種(属)~門レベル)
ごとに作成されます。
主成分の二次元プロット画像が階層(分類階級)ごとに作成されます。検体間の相違を散布図で示します。

価格・納期

区分製品名検体数単位単価
(税抜)
納期:DNA解析※1納期:RNA解析※2
A区分生体 アンプリコンシーケンス解析
【16S・ITS】
【DNA・RNA】
1~24検体32,000円24営業日~29営業日~
25~4825,000円
49~7222,000円
73~9620,000円
97~18,000円
1検体15,000円長納期
40営業日~
長納期
45営業日~
B区分生体 アンプリコンシーケンス解析
【16S・ITS】
【DNA・RNA】
1~24検体45,000円27営業日~32営業日~
25~4835,000円
49~7230,000円
73~9627,000円
97~24,000円
1検体20,000円長納期
40営業日~
長納期
45営業日~

※1 16SとITS2を同時に解析する場合には、納期は+5営業日の追加になります。
※2 RNAの場合、RNA抽出~RT-PCR費用として+18,000円の追加費用が必要です。

依頼書の入手と同意事項の確認

ご依頼前の同意事項、ご依頼前の同意事項(共通) およびテクノスルガ・ラボ基本約款 を確認してお申込み下さい。

・菌類の解析は、RDP解析のみとなります。
DNAとRNAを両方ともに解析を実施する場合には、解析費用は2倍になります。
メディア(DVD-R)による郵送納品のみとなります。
ご依頼前の同意事項(共通)を必ずご確認下さい。

ご依頼は、以下のファイルをダウンロード頂きお申し込み下さい。

  • 依頼書はコチラ