T-RFLPフローラ解析

特 長

  • 解析“1 run”のみで全体の菌叢を解析可能
  • 公的機関などの支援を受けて独自に開発した『Nagashima法(1)、(2)を採用
  • 簡便で培養の難易度に非依存的
  • 目~属レベルで細菌の相対比を解析し、菌叢変化を視覚化・数値化することが可能
  • ヒト以外にブタ、ニワトリ、イヌは制限酵素:BslⅠ、ネコは制限酵素:TaqⅠでデータベース化
  • 制限酵素2種類を用いた口腔内(唾液、舌苔、プラークなど)や皮膚、膣内フローラなどの解析が可能

概 要

T-RFLP (Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism) 解析は、末端蛍光標識したプライマーセットで鋳型DNAをPCR増幅し、制限酵素による消化後、フラグメント解析する方法です。DNA塩基配列の違いから制限酵素切断部位が異なることを利用し、検出ピークの強度、位置、数により評価・比較する断片多型性解析です。使用するプライマーや制限酵素の種類によって、該当するDNA断片の由来となる分類群は異なりますので、特定の分類群と照合する場合、前もってDNA断片サイズの予測が必要です。
Nagashima法は当社で腸内細菌叢(フローラ)を解析する方法として、食物、薬品、ストレス、疾患などの様々な要因により変動する宿主の腸内フローラを簡易的に比較するために開発しました。

腸内以外の生体由来検体

制限酵素2 種類を用いた口腔内(唾液、舌苔、プラークなど)や皮膚、膣内フローラなどの解析が可能です。

参考文献
(1) K. Nagashima et al., Application of New Primer-Enzyme Combinations to Terminal Restriction Fragment Length  Polymorphism Profiling of Bacterial Populations in Human Feces, Applied and Environmental Microbiology, 2003, vol.69 (2) 1251-1262.
(2) K. Nagashima et al., Phylogenetic Analysis of 16S Ribosomal RNA Gene Sequences from Human Fecal Microbiota and Improved Utility of Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism Profiling, Bioscience and Microflora, 2006, vol.25 (3) 99-107.

『Nagashima 法』に関する詳細は、当社特設ホームページをご参照下さい。

受入可能な検体

  • 生体由来検体A区分:糞便検体
  • 生体由来検体B区分:A区分以外
  • その他

由来検体の種類
ヒトヒト糞便
実験動物類マウス、ラット等の動物糞便、腸管内容物
家畜類ブタ、ウシ、ウマ等の動物糞便
家禽類ニワトリ等の家禽糞便、腸管内容物
ペット類イヌ、ネコ等のペット糞便
その他魚類、昆虫等の糞便、腸管内容物

由来検体の種類
ヒト
(その他動物種はご相談ください)
皮膚拭取物
膣内拭取物

由来検体の種類
DNA抽出物PCR増幅が確認されたDNA抽出物

必要検体量・送付方法

検体の種類必要量留意点および送付方法
A区分糞便、腸管内容物、 ルーメン液 採便容器(保存液なし) もしくは気密性の高い容器 0.2~0.5g採取後速やかに冷凍保存、冷凍輸送
採便容器(保存液あり)採取後速やかに冷蔵保存 冷蔵輸送推奨、常温輸送可
B区分A区分以外
(口腔内容物(唾液、プラーク))
1.5mLチューブなど0.2~1mL
(唾液)
唾液、舌苔、口腔粘膜、プラークを採取し、 速やかに冷凍保存、冷凍輸送
綿棒やコットンなどで広範囲を拭き取った検体は、極少量の適切な溶液(PBS、生理食塩水、滅菌水など)に移し、速やかに冷蔵保存、冷蔵輸送
血液、臓器、細胞組織の受け入れはお断りいたします。
DNA抽出物濃度
10ng/µL
総量
30µL以上
抽出後速やかに冷蔵保存、冷蔵輸送

糞便検体の返送

項目容器サイズ(内寸)単位価格
糞便検体返送(冷凍)最大:500mm×500mm×450mm1個43,000円~

作業の流れ

  • DNA抽出・精製
  • 蛍光標識したプライマーで PCR増幅
  • 制限酵素処理
  • フラグメント解析

仕 様

DNAシーケンサーで検体の細菌叢に由来する16S rDNA部分塩基配列のT-RFLP解析を行います。

納品内容

報告内容形式
OTUピーク面積比Excelファイル
菌叢を示すグラフExcelファイル

報告サンプル

価格・納期​

製品名区分検体数単位単価
(税抜)
納期
T-RFLPフローラ解析/BslⅠA区分1検体13,000円17営業日
T-RFLPフローラ解析/BslⅠ(長納期)1検体10,000円長納期
24営業日
T-RFLPフローラ解析/BslⅠB区分1検体お問い合わせ下さい
追加作業検体数単位単価
(税抜)
納期
秤量1検体1,000円~+2営業日
切り出し再PCR1検体3,000円+3営業日
糞便 混練作業※1、21検体1,000円~お問い合わせ下さい

※1 均一化のための糞便の混練作業です。別途、処分費が必要となることがあります。詳細は当社までお問い合わせ下さい。
※2 同一検体を複数の容器でお送りいただき、それらをまとめて秤量する場合、混練作業が必要な場合があります。

<オプション>データ解析

  • クラスター解析でクラスターもしくはカラーヒートマップを作成可能
  • 主成分分析を用いてデータの相違を散布図で可視化
  • 群間比較はグループ間のデータのばらつきを箱ひげ図を用いて可視化、統計学的検定を実施

価格・納期​

  • クラスター解析

フラグメントパターンを数値化し、類似度による集落(クラスター)を作成する方法です。クラスタリング方法のご選択は可能です。(Ward法、群平均法(UPGMA))。

  • 主成分分析

多くの変数に重み(ウェイト)をつけて少数の合成変数を作る分析方法です。主成分分析(表示方法:二次元)

  • 群間の比較

複数検体の群分けされた情報を元に群毎の比較を行う方法です。2群間の比較(マン・ホイットニーのU検定、対応のあるt検定からご選択下さい。)

受入可能な検体

検体の種類形式
当社より納品したT-RFLP解析のOTUテーブルExcelファイル

納品内容

製品名報告内容形式
クラスター解析検体の類似度を示すクラスター画像pdf、jpg、tiffファイル
主成分分析検体の類似度を示す主成分画像
群間比較群毎の類似度を示すクラスター画像

仕様

オプション名解析ソフトウェア形式
OTUピーク面積比R(1)またはJMPクラスター解析により検体間の比較をします。
主成分分析主成分分析により検体間の比較をします。
群間比較群間比較により群の比較をします。

(1) R Core Team. (2013). R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna.

報告サンプル

価格・納期

製品名検体数単位単価
(税抜)
納期
クラスター解析1~29 検体5,000円8営業日
30~検体3,000円お問い合わせ下さい
主成分分析1~29 検体5,000円8営業日
30~検体3,000円お問い合わせ下さい
群間比較1~29 検体5,000円8営業日
30~検体3,000円お問い合わせ下さい

依頼書の入手と同意事項の確認

ご依頼前の同意事項(共通) およびテクノスルガ・ラボ基本約款 を確認してお申込み下さい。

・秤量 および他分析項目を同時に行う場合には、必要量が変わりますのでお問い合わせ下さい。
・ 追加でリアルタイムPCR 解析を実施する場合、便量測定した上でDNA 抽出を行います。
・ 宿主の細胞由来の遺伝子が増幅された場合、切り出し再PCR を行います。
・ リアルタイムPCR 解析、または糞便理化学分析を同時あるいは追加で行う場合、当社保存液入りの採便容器は使用できません。
・ ご依頼前の同意事項(共通)を必ずご確認下さい。

ご依頼は、以下のファイルをダウンロード頂きお申し込み下さい。