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RT-PCR-DGGE解析(RT-DGGE解析)/細菌・アーキア(古細菌))・菌類

PCR‐DGGE解析と基本原理は同じですが、検体から核酸を抽出し、核酸中に含まれる混合RNAを逆転写PCR増幅(RT‐PCR)後、PCR‐DGGE解析と同様に片側のプライマーにGCクランプを付加したプライマーセットでPCR増幅します。

増幅された二本鎖DNAが分子量の違いだけではなく、変性のしやすさの違いによる移動度の差を利用して、変性剤濃度勾配ゲルで電気泳動し、バンドとして分離する解析手法です。

RNAは、微生物の活性を反映し、代謝活性の高い状態においてRNA量が多いことから、存在する全細菌(生細菌・死細菌を問わず)を対象とするPCR‐DGGE法と異なり、活性のある微生物の動的な群集構造を解析することが可能です。

 

RNAは、非常に不安定で分解し易いため、サンプリング前に当社までお問い合わせ下さい。

解析内容・報告形式

対 象

対象カテゴリー 遺伝子領域
細菌 16S rDNA V3領域 (約200 bp)
古細菌 16S rDNA V3領域 (約175 bp)
菌類 28S rDNA D2領域 (約260 bp)
特定分類群、機能遺伝子その他 Lactobacillus属などの特定分類群、機能遺伝子を用いたDGGE解析を希望される場合、別途お問い合わせください。

解析内容

項 目 内 容

RT-DGGE/PCR
予備試験
・RNA抽出やPCRの阻害物質となる油分などを含む特殊な検体や、微生物量が極めて少ない検体、過去に試験した実績のない検体で必要です。
・十分なPCR産物が得られることの確認の予備試験を行います。PCR予備試験では、各検体に適したPCR増幅条件の検討を行います。
・依頼書のご記入内容および実検体を確認させていただき、予備試験が必要な場合には、ご提案いたします。

RT-DGGE解析
1.PCR予備試験の条件にて検体を調製し、核酸を抽出(上述のPCR予備試験の内容説明参照)
2.RNAを鋳型としたPCR増幅
3.DGGE解析
4.ゲルの写真撮影
5.ゲルからDNAバンドの切り出し(バンド切り出しありの場合のみ)

「バンド切り出しあり」の場合には、RT‐PCR-DGGEゲルの写真に、検体ごとに鮮明なバンド(切り出し後、DGGEバンド塩基配列解析で配列が得られる可能性が高いバンド)にアルファベットのa,b,c…を付記し、画像として報告します。

DGGEバンド塩基配列解析を追加する際に指定する番号(例、‐01‐a, ‐03‐e)となります。「バンド切り出しなし」の場合、アルファベット表記はありません。

 

報告形式

検体区分・必要検体量・送付方法

価格・納期

同時にDGGE 解析とRT‐PCR‐DGGE 解析を行われる場合、核酸抽出の費用を値引きします。

DGGE バンドの数値化として、RT-DGGE 解析の結果(画像)で得られたバンドパターンを数値化します。さらにDGGE 数値化データを用いて、クラスター解析および主成分分析を行います。RT-DGGE 解析の結果は、当社で実施したもの以外でも、画像をご提供いただければ解析を実施可能です。

 

クラスター分析とは、バンドパターンを数値化したデータを似たものを集めて集落(クラスター)を作り、対象を分類しようという方法です。

 

主成分分析とは、多くの変数に重み(ウェイト)をつけて少数の合成変数を作る分析方法です。

オプション

※1 DGGE バンドの数値化は、同一ゲル上のRT-PCR-DGGE バンドに限ります。またバンドの輝度を表す数値を解析に用いるかについてはご選択可能です。

※2 ward 法、群平均法からご選択可能です。

※3 表示方法:二次元、三次元がご選択可能です。

・解析方法内容について仕様書を作成し、見積書と共に提案します。

ご依頼前の同意事項

RT-PCR-DGGE解析は、1回につき16検体まで同一ゲルでの泳動が可能です。17検体以上を同時に比較・解析が必要な場合、当社までお問い合わせください。

帰属分類群の推定は、バンドの位置だけでは判断できません。別途、「DGGE バンド配列解析」をご利用ください。

・当社が発行する検体識別番号で報告します。

・解析結果に関する考察は一切いたしません。

・印刷物による納品も選択して頂けます。北海道、沖縄県、九州地方などでは輸送により納品日が変動いたします。

・RNA 抽出するために特別な前処理が必要な場合には、別途、前処理費用をご負担いただきます。

・特殊な検体(油分含有土壌)などは、PCR 増幅反応を著しく阻害する物質が含まれることがあり、これらの影響を受けないような特殊な前処理が必要であることからPCR 予備試験の実施をお奨めします。詳しくは当社までお問い合わせください。

・切り出したバンドの返送は、送料および箱代、梱包費用などを含む返送費 2,000 円(税抜)をご負担いただきます。

・「バンド切り出しなし」の解析後に、バンド切り出しをご要望の場合には、DGGE 解析(バンド切り出しあり)をあらためて実施させて頂く必要があります(費用はお客様ご負担)。

・検体の種類に応じた当社標準の核酸抽出プロトコールにて調製します。プロトコールの指定は、別途お問い合わせください。 PCR予備試験やPCRで十分なPCR産物の得られない検体は、条件を変更して再解析をします。再解析でも十分なPCR産物の得られない場合は、作業内容と結果をご報告のうえ、それまでに行った作業の費用全額をご請求します。

・抗菌剤・化学物質などを投与されている場合には、検体中の菌数が少なくPCRできない場合があります。この場合には、それまでに行った作業内容をご報告のうえ、作業の費用全額をご請求します。

・生体由来検体の返送をご希望のお客様には、定温マルチBOXによる臨床検体輸送サービス(36,000円~)を使用してお送りします。

・ご送付検体の処分が困難な(危険・有害物質の含有等)場合や余剰量が多くある場合、「当社で処分」をご選択された際にも、当社判断により返送させていただくこともあります。

複数検体を一度にご依頼の場合は、

検体リスト(エクセルファイル)をダウンロードして御利用下さい。

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