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次世代シーケンス・アンプリコン解析

[DNA対象:細菌・アーキア(アーキア(古細菌))・菌類

                 RNA対象:細菌・アーキア(アーキア(古細菌))]

次世代シーケンス・アンプリコン解析は、糞便、唾液、汚泥や土壌などの多様な生物種が混在する検体中の生物群集を解析する最も優れた方法のひとつです。

 

生物種が混在する検体から直接抽出した混合DNA について、検体を識別するためのバーコード配列を付加したプライマーによりPCR 増幅~シーケンス解析を行い、一度に数万~数十万の配列を得る手法です。

 

検体毎に異なるバーコード配列が付加されているため、数十種類の異なる検体由来の混合DNA を一度に解析しても、バーコード配列をもとに得られた塩基配列がどの試料に由来するかを判別することができます。

 

一度の解析で大量の塩基配列を得ることができることから、短時間でマイナーな細菌の検出も可能であり、T-RFLP、クローンライブラリー、DGGE などの従来法よりも検出感度が高いと考えられます。さらに、従来法よりも多検体、多数の塩基配列解析を行う場合のコストパフォーマンスに優れています。

 

また、DNA を解析対象とする次世代シーケンス・アンプリコン解析では全細菌(生細菌・死細菌を問わず)を対象とします。一方、RNA は微生物の活性を反映し、代謝活性の高い状態においてRNA 量が多いことから、RNA を解析対象とする場合には、活性のある微生物の動的な群集構造を解析することが可能です。

 

RNA を解析対象とする場合には、検体から抽出した核酸中に含まれる混合RNA を逆転写PCR 反応(RT‐PCR)を行い、得られたcDNA を鋳型にPCR 増幅を行います。RNA は、非常に不安定で分解し易いため、サンプリング前に当社までお問い合わせ下さい。

 

解析内容

解析対象

解析対象:DNA 解析対象:RNA
1.DNA抽出、精製 1.核酸抽出、RNA精製および、RT-PCR増幅
2.PCR増幅
3.リアルタイムPCRによる各PCR産物の定量
4.シーケンス
5.DNA塩基配列決定(fastqファイル取得)
6.Fastq-joinによるペアエンド配列のアッセンブル
7.クオリティフィルタリング(fastaファイル取得)および、キメラフィルタリング
8. データ解析

解析概要

対象微生物の種類と解析対象を選択下さい。

対象微生物 細菌・アーキア(古細菌)一括注1)
細菌
アーキア(古細菌)
菌類
解析領域 16S rDNA V3 ~ V4領域 ITS2
リード長注2) 細菌 約430 bp/アーキア(古細菌) 約380 bp 270~340 bp
データベース注3) Ribosomal database project (RDP)
および、
当社「微生物同定データベース」
Ribosomal database project (RDP)
解析対象 DNA/RNA DNA
リード数注4) 1万リード以上/検体
報告データ 塩基配列(fastqおよびfasta形式)、
エクセルファイル(データ解析)USBメモリ、またはDVD-Rに収録し、納品
解析機種 MiSeq (Illumina)

注1) 糞便、腸管内容物には細菌・アーキア一括プライマーを推奨いたします。

注2) プライマー配列を除いた配列を取得します。

注3) データ解析の詳細は、次世代シーケンスデータ解析をご覧下さい。

注4) クオリティフィルタリング、キメラフィルタリング後のリード数です。

  •           ご報告のデータ解析とグラフのガイド

     

     

    ドーナツグラフ

    各検体で得られたDNA塩基配列の帰属分類群を門、網、目、科、属、種の各階層で、ドーナツグラフの中心から外側へ順に示します。

    異なる分類階層(門~属または種レベル)の帰属分類群とその割合を一つのグラフで同時に示すことで、群集構造の理解を視覚的にサポートします。

    htmファイルで納品します。グラフ上でカーソルを移動することにより、各階層の各分類群の名前が表示されます。

    検体間比較グラフ

    RDPでは属~門レベルまで、テクノスルガ・ラボ微生物同定データベースでは種~門レベルの各分類階層で、帰属分類群の内訳を示します。図は、糞便、唾液、皮膚、土壌、汚泥、河川水の計6検体を種レベルで比較した結果を示します。

    ドーナツグラフ

    デンドログラムおよび、ヒートマップ画像が階層(種(属)~門レベル)ごとに作成されます。

    主成分分析

    主成分の二次元プロット画像が階層ごと(種または属~門レベル)に作成されます。検体間の類似度の違いを散布図で示します。

報告書サンプル

検体区分・必要検体量・送付方法

※腸管を除去した検体のみ受け入れ可能です。

価格・納期

※ 1  当社採便キット/採便容器を購入使用し、解析を依頼して頂いた場合には、1 検体あたり1,000 円をお値引きいたします。

※ 2   当社「微生物同定データベース」は、菌類の解析には、対応しておりません。

 

  • 生体由来検体の返送を希望のお客様には、定温マルチBOX による臨床検体輸送サービス 43,000 円(税抜)~ を利用してお送りします。
  • DNA とRNA を両方実施する場合には、解析費用は2倍になります。

ご依頼前の同意事項

  • データを収録したDVD-R の納品は、原則1式です。DVD-R の追加納品を希望の場合には、手数料3,000 円(税抜)を負担して頂きます。
  • DNA 抽出物でのご依頼は、PCR 増幅を確認している検体に限らせて頂きます。
  • PCR 産物でのご依頼は、原則としてお断りいたします。
  •  納品したデータの再発行は、報告書の発行後1 年までとさせていただきます。
  • 特殊な検体(油分含有土壌など)は、PCR 増幅反応を著しく阻害する物質が含まれることがあり、これらの影響を受けないような特殊な前処理を
  • 抗菌剤・化学物質などを投与されている場合には、検体中の菌数が少なく解析できないことがあります。この場合には、それまでに行った作業内容を報告のうえ、作業の費用全額を請求いたします。
  • ご送付検体の処分が困難な(危険・有害物質の含有等)場合や余剰量が多くある場合、「当社で処分」を選択してされた際にも、当社判断により返送させて頂くこともあります。

複数検体を一度にご依頼の場合は、

検体リスト(エクセルファイル)をダウンロードして御利用下さい。

株式会社テクノスルガ・ラボ

TEL:  054-349-6211

Email:  tsl-contact@tecsrg.co.jp

住所:  〒424-0065 静岡県静岡市清水区長崎330

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