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DGGEバンド塩基配列解析キット

通常、DGGEバンド塩基配列解析においては、PCRプライマーと同一の2種類のプライマーをシークエンスプライマーとして用いて両鎖で解析を行なっています。

 

サンガー法でのシークエンス解析は、現在、約800 bp程度の塩基配列を得ることが可能であるにもかかわらず、約200 bp程度のDGGEバンド由来のPCR産物を両鎖で解析が行われることが一般的です。

 

その理由は、PCR産物のダイレクトシークエンスを行う場合、プライマー領域直後の20 bp~30 bpほどの塩基配列が得られないためです (図1および図2)。

 

そのため、PCR産物の全長の塩基配列を得るためには、両鎖での解析に加えて、それぞれのシークエンスプライマーで得られた塩基配列を結合するアッセンブルが必要でした (図2)。

 

 

 

当社では、PCRプライマーならびにシークエンスプライマーに改良を加えることで、上記の問題を解決し、片鎖 (1シークエンスプライマー) の塩基配列解析でプライマーサイトを含むDGGEバンド由来PCR産物の全長の塩基配列 (約200 bp) を解析できるキット (DGGE band sequencing kit for analysis of the bacterial V3 region) を開発しました (図3)。

 

本キットを用いることにより、1シークエンス反応でDGGEバンド由来のPCR産物の全長が解析可能です(図4)。

・切り出しバンドの精製

*技術情報バンド精製の重要性参照

・PCR Primer Mix を用いてPCR

・PCR 産物の精製

・Sequencing Primer

を用いてシーケンス

図4. DGGE バンド切り出し後の実験フロー

  •         技術情報 DGGEバンドの精製の重要性

     

     

    DGGE バンドの精製とは、 「DGGE 解析やRT‐DGGE 解析で得られた目的のDGGE バンドを切り出し、PCR 増幅し、再度 DGGE で目的の位置に単一であることを確認する。」という作業です。 DGGE バンドに含まれるDNA を単一化(純化)すると同時に、切り出したDGGE バンドが、目的とする位置のDGGE バンドであることを確認するための重要な作業となります。

     

    例えば、目的のDGGE バンドの精製が不十分な状態で、DNA 塩基配列解析を行った場合、

    ①複数の微生物に由来するDNA 塩基配列が混ざり、目的のDNA 塩基配列が決定できない。

    ②DNA 塩基配列が得られたが、同じレーンの異なる位置の最優占種のDGGE バンドと同じであるというケースがあります。

     

    特に②のケースのように、目的のDGGE バンドではないDNA 塩基配列が得られる誤りを防ぐためには、DGGE バンドの精製時における再DGGE によるDGGE バンド位置確認が必須となります。当社では個々のDGGE バンドの精製の際には、必ず目的の位置にDGGE バンドが単一にあることを確認しています。

    レーン1: DGGE解析結果

    レーン2: 切り出しバンドの精製(純化)/ 1回目

    レーン3: 切り出しバンドの精製(純化)/ 2回目

    レーン4: 切り出しバンドの精製(純化)/ 3回目

    レーンM: DGGEマーカー

              : 解析対象バンド

     

    DGGE解析のご依頼からDGGEバンド塩基配列解析開始までのフロー

    DGGE解析のご依頼

    → DGGE解析

     → バンドの切り出し

    → DGGE解析報告

    →バンド塩基配列解析

    → DGGEバンドの精製

    → バンドの単一化

    → 塩基配列解析

     

説明

製品内容・保存方法

PCR Primer Mix            100 μl ×1本

Sequencing Primer (10 pmol/μl)     20 μl ×1本

Positive Control           50 μl ×1本

(25μL反応系で、50 反応分)

製品内容

-20℃

※ 短期間(3ヶ月以内)であれば、2~8℃で保存可能です。

保存方法

価格・納期

ご依頼前の同意事項

  • 本キットに含まれるプライマーの塩基配列は、開示いたしません。
  • 本キットには、DNA精製試薬、プライマーを除くPCR反応試薬およびシークエンス反応試薬は、含まれておりません。キット以外に解析に必要な試薬、機器などは、お客様でご用意ください。
  •  本製品は、研究用試薬ですので、ヒトへの医療、臨床診断には使用しないようご注意ください。本製品を用いた検査結果判定により発生する問題に関して、当社は一切の責任を負いません。
  • 本製品の再販、および本製品を改変し再販することに起因する損失・損害等については、当社では一切の責任を負いません。
  • 仕様は、予告なく変更する場合があります。

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