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群集構造解析

  •          微生物群集構造解析/手法の比較

     

     

    環境中には、分子生物学的手法により様々な微生物種の存在が確認されていますが、培養可能な微生物はごくわずかにすぎず『環境中に存在している微生物の99%以上は、未知の微生物である』とも言われています。未だ、複数の微生物が混在するサンプルに含まれる全ての微生物の帰属分類群を完全に把握する手法は存在しませんが、その手がかりを得る手法が近年開発されています。群集構造全体を視覚化や数値化により解析する方法と、特定の分類群や帰属種に絞って解析する方法に分類されます。

    注1) 上記は、あくまでも当社の経験に基づき、当社で解析可能な参考情報です。微生物群集構造解析は、従来の分離培養法と比較して、微生物の群集構造を忠実に反映した方法と考えられていますが、全く偏りなく、全ての分類群の検出マーカーとなる物質を等しい効率で取得、検出することは困難とされ、より正確な群集構造を反映した結果を得るためには、各種手法を駆使した総合的な解析が必要とされます。

    注2)菌株が登録されている配列の分類群の推定能を示したもので、データベースに培養株の菌種がない場合は除いています。

    注3)次世代シーケンス・アンプリコン解析については、1万配列を解析した場合の検出感度を示しています。クローニングについては、100クローンを解析した場合の検出感度を示しています。

    注4)キノンプロファイル解析では、1検体あたり、乾燥重量で2mg相当以上の細菌が存在すれば検出が可能です。

    注5)T-RFLP解析の分類群の推定は、データベースに依存します。

分析に必要な検体量・検送付方法でお困りの場合はこちら

  •          微生物の定量に関する測定・解析ガイド

     

     

    当社ではこれまでに、「発酵食品、乳酸菌飲料、微生物製剤など」の飲食品、「環境水、活性汚泥、土壌など」の環境検体、「糞便、唾液など」の生体検体といったさまざまな検体に含まれる菌数を知りたいとのご要望に応じ、適した測定・解析をご提案し、ご報告してきました。

    微生物の定量分析について、お問い合わせの多い検体の種類と可能な分析方法を下表にまとめました。

    養法による菌数測定は、ご指定の培養条件で生育可能な微生物の菌数を調べます。選択培地を用いることで、特定の分類群や特定の機能をもつ微生物の菌数を測定することもできます。難培養微生物や選択培地がない特定の微生物を測定することはできません。検体に含まれる微生物を培養株として得られるので、引き続き同定を行ったり、後に利用するために微生物を保存したりすることが可能です。

    光染色法による菌数測定は、培養を介さずに検体中に含まれる微生物細胞を蛍光染色し、蛍光顕微鏡を用いて、細胞を計数します。特定の分類群を検出・測定することは出来ませんが、検体に含まれる全菌数および生菌数を測定できます。検体の種類によっては、細胞がうまく分散するか、夾雑物が測定結果に影響しないかなどの予備検討が必要となることがあります。放線菌や菌類については、「1細胞」の定義が難しいため、測定ができません。

    アルタイムPCR解析は、培養を介さない遺伝子を用いた分子生物学的手法であることから、培養可能な微生物だけでなく、培養できない微生物も対象に定量を行うことができます。特定分類群に特異的なプライマーを使用し、リアルタイムPCR装置でモニタリングすることで、検体から抽出したトータルDNAに含まれる特定分類群の遺伝子のコピー数(細胞数ではない)を推定する方法です。ご要望に応じて、特定分類群を特異的に検出するプライマーの設計も行います。リアルタイムPCR法では、DNAを対象として解析を行うため、検体中の対象分類群の生死に関係なく検出します。

    次世代シーケンス・アンプリコン解析による微生物群集構造の網羅解析などの16S rDNAを用いた各種微生物群集構造解析を組み合わせることにより、さまざまな種類の検体で半定量的に微生物群集構造を明らかにすることも可能です。

    検体の種類と微生物の定量に関する測定・解析方法

    飲食品、環境検体、生体検体、菌数測定(培養法)、蛍光染色法、リアルタイムPCR 、キノンプロファイル解析、

    ○:分析可能

    △:飲食品のリアルタイム PCR 解析は原理的に可能ですが、あまり一般的ではなく、蛍光染色法による菌数測定が一般的です。

    ノンプロファイル法は、呼吸鎖における電子伝達物質であるキノンを分析対象とした化学的微生物群集構造解析手法の一つです。ほぼ全ての微生物で優占キノン種は一種であることから、各キノン種はそのキノンを有するバイオマスの指標として利用可能であり、総キノンの絶対量は環境評価指標(例えばBODやCOD)とも相関が見られます。キノンプロファイル法では、ユビキノン‐10は主にα-プロテオバクテリアの変化といったように、門レベルなどの高次分類階級での微生物群集構造を定量的に調べることが可能です。本法は土壌や底泥などの環境試料間の識別能に優れ、その相違をクラスター解析および主成分分析で表すことも可能です。

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