次世代シーケンス・アンプリコン解析

説明

糞便、唾液、汚泥や土壌などの多様な生物種が混在する検体中の生物群集を解析する優れた方法のひとつです。生物種が混在する検体から直接抽出した混合DNA について、検体を識別するためのバーコード配列を付加したプライマーによりPCR 増幅~シーケンス解析を行い、一度に数万~数十万の配列を得る手法です。

検体毎に異なるバーコード配列が付加されているため、数十種類の異なる検体由来の混合DNA を一度に解析しても、バーコード配列をもとに得られた塩基配列がどの試料に由来するかを判別することができます。
一度の解析で大量の塩基配列を得ることができることから、短時間でマイナーな細菌の検出も可能であり、T-RFLP、クローンライブラリー、DGGE などの従来法よりも検出感度が高いと考えられます。
さらに、従来法よりも多検体、多数の塩基配列解析を行う場合のコストパフォーマンスに優れています。

試験内容

対象微生物 細菌・アーキア※1 菌類
解析領域 16S rDNA V3 ~ V4領域 ITS2
リード長※2 細菌 約430 bp / アーキア 約380 bp 270~340 bp
データベース※3 RDP、および当社「微生物同定データベース」 RDP
解析対象 DNA/RNA DNA
リード数※4 1万リード以上/検体
報告データ 塩基配列(fastqおよびfasta形式)、エクセルファイル(データ解析)
DVD-Rに収録し、納品
解析機種 MiSeq (Illumina)

※1 糞便、腸管内容物は細菌・アーキア一括プライマーを推奨します。
(技術情報 『糞便検体のプライマーについて』をご参照下さい)
※2 プライマー配列を除いた配列を取得します。
※3 RDP(Ribosomal database project)は公共の解析データベースです。
※4 クオリティフィルタリング、キメラフィルタリング後のリード数です。

DNA対象 RNA対象
1.DNA抽出、精製 1.核酸抽出、RNA精製
および、 RT-PCR反応
2.PCR増幅
3.リアルタイムPCRによる各PCR産物の定量
4. シーケンスとDNA塩基配列決定(fastqファイル取得)
5.Fastq-joinによるペアエンド配列のアッセンブル
6.クオリティフィルタリングおよび、キメラフィルタリング(fastaファイル取得)とデータ解析

補足

DNA を解析対象とする次世代シーケンス・アンプリコン解析では全菌(生菌・死菌を問わず)を対象とします。

一方、RNA は微生物の活性を反映し、代謝活性の高い状態においてRNA 量が多いため、RNA を解析対象とする場合、活性のある微生物の動的な群集構造を解析することが可能です。

RNA を解析対象とする場合には、検体から抽出した核酸中に含まれる混合RNA を逆転写PCR 反応(RT‐PCR)をし、得られたcDNA を鋳型にPCR 増幅を行います。

RNA は、非常に不安定で分解し易いため、サンプリング前に当社までお問い合わせ下さい。

データベースの特徴

データベース 内     容 分類群の推定精度
RDP: Multiclassifier RDPによる帰属分類群の推定を行います。検体ごとに各分類群と配列数を表記いたします。
検体ごとの菌群数をもとに界~属レベルのドーナツグラフを作製します。また検体間の比較グラフの作製およびクラスター解析・主成分分析を用いて検体間の比較を行います※2
界~属
テクノスルガ・ラボ
「微生物同定データベース」※1
当社微生物同定データベースによる相同性検索を行います。検体ごとに各菌群名と配列数を表記いたします。
検体ごとの菌群数をもとに界~種レベルのドーナツグラフを作製いたします。また検体間の比較グラフの作製およびクラスター解析・主成分分析を用いて検体間の比較を行います※3
界~種

※1 国立遺伝学研究所 生命情報・DDBJ 研究センターのご支援により当社が構築した「微生物同定データベース」は、帰属分類群の推定に重要である基準株やタイプ株などに由来するDNA 配列データで構成されており、当社の微生物同定システム「ENKI®」にも使用されています。本データベースにおけるBLAST のcut-off 条件は、相同率97%となっておりますが、この他の相同率の設定も可能ですのでお問い合わせ下さい。ただし、相同率が低い場合にヒットした細菌種は、最近縁種となりますので予めご留意下さい。

※2 クラスター解析および主成分分析はMetagenome@KIN(株式会社ワールドフュージョン)を用いて解析いたします。他のソフトを用いて解析をご希望される場合には、別途ご連絡下さい(別途費用)。クラスター解析では、クラスタリング手法(群平均法;UPGMA)および距離関数(ピアソンの相関係数)をデフォルト設定としていますが、このほかの設定を希望される場合には、予めご連絡下さい。

QIIMEを用いた解析の追加も可能です。次世代シーケンス・アンプリコン データ解析/QIIME ページをご参考下さい。

報告内容

  • ドーナツグラフ
  • 解析例
  • 検体間比較グラフ
  • クラスター解析
  • 主成分分析

 

各検体で得られたDNA 塩基配列の帰属分類群を界、門、網、目、科、属、種の各階層で、ドーナツグラフの中心から外側へ順に示します。

異なる分類階層(門~属または種レベル)の帰属分類群とその割合を一つのグラフで同時に示すことで、群集構造の理解を視覚的にサポートします。
html ファイルで納品します。グラフ上でカーソルを移動することにより、各階層の各分類群の名前が表示されます。

 

・ 当社「微⽣物同定データベース」による界〜種レベルの解析例です。RDP では、界〜属レベルの解析結果をご報告いたします。
・ ⼀覧をエクセルファイルで納品いたします。

RDP では界~属レベルまで、テクノスルガ・ラボ微生物同定データベースでは種~門レベルの各分類階層で、帰属分類群の内訳を示します。図は、糞便、唾液、皮、土壌、汚泥、河川水の計6 検体を種レベルで比較した結果を示します。
デンドログラムおよび、ヒートマップ画像が階層(種(属)~門レベル)
ごとに作成されます。
主成分の二次元プロット画像が階層(分類階級)ごとに作成されます。検体間の相違を散布図で示します。

必要検体量・送付方法・検体区分・糞便検体の返送

必要検体量・送付方法は、以下の表より【生体由来検体】をご参考下さい。

検体の種類 必要量 留意点および送付方法
環境検体  活性汚泥 5~10mL 採取後速やかに冷蔵保存、冷蔵輸送
 土壌
堆肥
コンポスト
1~5g
 環境水
(海水、地下水など)
100mL~1L
 培養液 5~10mL
生体由来検体 A区分 糞便
腸管内容物
採便容器(保存液なし)
もしくは
気密性の高い容器
0.2~0.5g 採取後速やかに冷凍保存、冷凍輸送
採便容器(保存液あり)   採取後速やかに冷蔵保存、冷蔵輸送推奨、常温輸送可
B区分  A区分以外
口腔内容物
唾液
プラーク

皮膚表面採取物など
1.5mLチューブなど 0.2~1mL(唾液) 綿棒やコットンなどで広範囲を拭き取った検体は、極少量の適切な溶液(PBS、生理食塩水、滅菌水など)に移し、速やかに冷蔵保存、冷蔵輸送
DNA抽出物 濃度:10ng/µL
総量:20µL以上
採取後速やかに冷蔵保存、冷蔵輸送

糞便検体の返送を希望のお客様には、定温マルチBOX による臨床検体輸送サービスを利用してお送りいたします。

項   目 容器有効内寸 単位 価格
糞便検体返送(冷凍) 最大:500 mm×500 mm×450 mm 1個 43,000円~

価格・納期

価格は、DNAを対象とした分析として表示しております。
RNAを分析対象とした際は、以下の抽出作業の追加費用がかかります。

抽出追加費用 単 位 追加費用
RNA抽出~RT-PCR 検体 +18,000円
  • 生体由来検体A 区分
  • 生体由来検体B 区分・環境検体
項目 検体数 単位 単価 納期
DNA解析 RNA解析

次世代シーケンス・アンプリコン解析
解析:RDP

および、

当社「微生物同定データベース」

1~24 検体 60,000円 25営業日~ 30営業日~
25~48 37,000円
49~72 27,000円
73~96 21,000円
97~ 19,000円
1 検体 19,000円 長納期
40営業日~
長納期
45営業日~
項目 検体数 単位 単価 納期
DNA解析 RNA解析

次世代シーケンス・アンプリコン解析
解析:RDP

および、

当社「微生物同定データベース」

1~24 検体 68,000円 32営業日~ 37営業日~
25~48 44,000円
49~72 33,000円
73~96 27,000円
97~ 24,000円
1 検体 24,000円 長納期
40営業日~
長納期
45営業日~

依頼書の入手と同意事項の確認

ご依頼前の同意事項、ご依頼前の同意事項(共通) およびテクノスルガ・ラボ基本約款 を確認してお申込み下さい。

・ 当社採便キット/採便容器を購入使用し、解析を依頼していただいた場合には、1 検体あたり1,000 円をお値引きいたします。
・ 菌類の解析は、RDP 解析のみとなります。
・ DNA とRNA を両方ともに解析を実施する場合には、解析費用は2 倍になります。
・ ご依頼前の同意事項(共通)を必ずご確認下さい。

分析のご依頼は、以下のファイルをダウンロード頂きお申し込み下さい。

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