糞便からのDNA 抽出方法

こ腸内フローラ解析においてDNA 抽出法の選択は、結果に重要な影響を及ぼします。
DNA 抽出には、大きく溶菌と精製の工程があり、溶菌工程では化学処理と組み合わせたビーズ破砕法を代表とする物理処理または酵素処理が用いられており、精製工程では磁気ビーズ法、スピンカラム法またはフェノール-クロロホルム法が用いられています。

当社では凍結糞便や保存液に懸濁した糞便からのDNA 抽出法にグアニジン溶液の使用とビーズ破砕法を採用することにより、溶菌効率の低いBifidobacterium 属やClostridium 属を代表とするグラム陽性細菌の検出率を高めた方法となっています (図1)。

図1.当社で実施しているDNA抽出・精製法

当社保存液入りの採便キット(容器)を使用した検体からのDNA 抽出は、保存液に含まれるグアニジン塩などの作用により採便後の保存時においても酵素の不活化と溶菌が進行することから、室温で保管しても糞便採取時の菌叢維持の一助になっています(Hosomi et al., Scientific Reports2017)

また、得られた抽出DNA は、T-RFLP 法や次世代シーケンサーを用いたアンプリコン解析、ショットガンメタゲノム解析に使用可能です。当社保存液入りの採便キット(容器)使用上の留意点として、当社推奨とは異なる抽出方法や試薬などを採用した場合、例えば抽出作業の初期に遠心により糞便と上清を分離し、上清を除くという作業をした場合には、グアニジン溶液の作用により保存液中に溶菌した微生物由来のDNA が沈降せずに除かれることに留意する必要があります (Hosomi et al., Scientific Reports2017)。
保存液入り糞便検体からのDNA 抽出時、遠心後に上清除去をすると菌叢が変化するため、糞便懸濁液からの抽出を推奨します。

表1.保存液入り採便容器から遠心せずにDNA 抽出が行えることを確認したDNA 抽出キット
キット名 メーカー
MORA-EXTRACT Kyokuto Pharmaceutical, Tokyo, Japan
ISOSPIN Fecal DNA  Nippon Gene, Toyama, Japan
ISOIL for Beads Beating  Nippon Gene, Toyama, Japan
NucleoSpin DNA Stool  MACHEREY-NAGEL, France
NucleoSpin DNA Stool  MO BIO Laboratories, USA
PowerSoil DNA Isolation Kit  MO BIO Laboratories, USA

上記のDNA 抽出Kit を用いずにDNA 抽出を行う場合は、以下の方法を推奨します。

  • スプーン型: 保存液に懸濁された糞便をTE バッファーで5~10 倍程度に希釈し、遠心分離せずにDNA 抽出にご使用下さい。
    0.1g 以下の便を採取いただき、採取後1 週間以内に冷蔵にて保管下さい
  • ブラシ型 :保存液に懸濁された糞便を遠心分離せず、そのままDNA 抽出にご使用ください。